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quinta-feira, 28 de abril de 2011

Preparo de Material Biológico para Microscopia Eletrônica de Varredura

      O microscópio eletrônico de varredura (MEV) forma imagens essencialmente tri-dimensionais e de grande efeito plástico, com uma notável profundidade de foco. Estas imagens são produzidas através da interação inicial de um feixe de elétrons com a amostra, que é mantida sob condições de alto vácuo.  
       Os métodos de preparo visam justamente contornar ou minimizar estas condições adversas, tornando as amostras resistentes e condutoras. Assim se pode dizer que o sucesso de uma boa preparação é fundamental para se garantir a melhor imagem.
      As aplicações da microscopia eletrônica de varredura em biologia incluem desde objetos macroscópicos (organismos inteiros, partes vegetais, órgãos isolados, capilares, células de cultura) até o estudo de macromoléculas orgânicas, frações celulares, etc.


Obtenção das amostras
                 Esta etapa inclui a coleta, seleção e limpeza, que visa remover matérias estranhas como muco e poeira, da superfície a ser estudada, porém sem afetar suas características originais. Superfícies ciliadas são especialmente suscetíveis à adsorção de contaminantes, e devem ser bem limpas antes da aplicação do agente fixador.
     A seleção da amostra será conduzida sob um microscópio estereoscópico, usando-se um pincel fino, um palito (agulha) ou uma pipeta, se a manipulação se der em meio aquoso; evitar o uso de pinça. As amostras como regras devem possuir as dimensões mínimas necessárias para o estudo que se pretende realizar, uma vez que as dificuldades durante a observação no MEV crescem em proporções direta com o seu volume; por outro lado, os cuidados durante a manipulação precisam ser redobrados quando as amostras são excessivamente pequenas, não ultrapassando de espessura de 1,0mm.

Estabilização da forma (fixação)
      É o processo através do qual se preserva o estado original de um espécime vivo, evitando-se ao máximo a introdução de artefatos. A duração da fixação é intencionalmente longa, visando melhor penetração do fixador e aumentar a resistência física da amostra. A fixação é geralmente feita por imersão da peça na solução fixador tamponado. Na escolha do tipo de fixador ou do roteiro de fixação devem-se considerar as dimensões da amostra, a informação pretendida e a disponibilidade dos reagentes químicos (em especial do tetróxido de ósmio). Glutaraldeído ou mistura de aldeídos são geralmente agentes fixadores de escolha universal.

Preparo do fixador de Karnovisky
SOLUÇÃO A - Água destilada + paraformaldeido + NaOH
Aquecer no microondas e verificar a transparência (± 30 seg./potencia máxima) ou em agitador por ± 15 min em temperatura alta até dissolver todo paraformaldeído. Após, Filtrar.
SOLUÇÃO B - Tampão de Cacodilato de Sódio 1M + Glutaraldeido + CaCl2

SOLUÇÃO A + SOLUÇÃO B, completar para 100ml de tampão cacodilato 0,1M e acertar pH 7,4. Conservar em geladeira.

 
Pós-fixação
                 Fixar em Tetróxido de Ósmio por 4horas. Assim, o material fica com uma cor escura (negra), o que ajuda no contraste no momento da observação ao MEV. Durante a pós-fixação é necessário lavar o material em água destilada por 3 vezes para retirar o excesso do Ósmio. Logo em seguida,  executa-se os seguinte procedimentos:

Desidratação
                  É feita basicamente com concentrações crescentes de álcoois iniciando de 30% até ao absoluto (100%).

 
Secagem das amostras
                  
A secagem final das amostras é feita sob condições que por ela não passa um menisco de transição de fase. Isto se consegue na Câmara de “ponto critico”, geralmente usando dióxido de carbono.

PROCEDIMENTO DO PONTO CRITICO: Leva-se a amostra já fixada e completamente desidratada à Câmara de Ponto Crítico, em um pequeno volume de etanol absoluto. Com a Câmara isolada, injeta-se o CO2 líquido, fazendo-se várias substituições até a remoção total do etanol. Eleva-se então a temperatura da câmara até 40-45°C, bem acima da temperatura crítica e, com o aumento gradual da temperatura, as moléculas adquirem energia cinética e se convertem em gás, o que faz aumentar simultaneamente a pressão interna da câmara. À medida que isso ocorre, a densidade da fase líquida é reduzida, e a fase gasosa é aumentada. Nesta situação, a tensão superficial é igual a zero e todo líquido se converteu em gás. Assim evita-se o efeito da tensão superficial sobre as amostras, e após isto ela é removida da Câmara seca e pronta para ser coberta com ouro. O dióxido de carbono é inerte e barato por isso geralmente adotado no método e o grau de pureza máxima do fluido é essencial para evitar contaminações. O aparelho que realiza o processo de ponto crítico pode ser de Marca IMS Modelo 850.

Montagem
                  O espécime seco precisa ser montado de modo adequado no suporte porta-amostra do MEV (“stub”), ajustando-se a melhor orientação em relação ao feixe de elétrons e ao coletor. Vários tipos de adesivos podem ser usados: cola de prata coloidal, fita adesiva, esmalte de unha contendo carbono coloidal etc. Após a colagem, as amostras, são inicialmente adsorvidas ao seu porte.

Metódos de impregnação metálica
                 É realizado para intensificar a adsorção internamente dos tecidos, de um metal condutor no caso o Tetróxido de Ósmio. Isto se faz através de um agente mordante bi-funcional, que age como uma ponte molecular entre o espécime e o “corante” eletrônico. O aumento da condutividade propicia trabalhar-se no MEV em condições de ótima resolução, ainda com metalização interna, o tecido adquire maior resistência mecânica.

A COBERTURA COM OURO: Promove o aumento da condutividade da superfície da amostra através de uma fina camada (até 20-30nm de espessura) de metal, de preferência, ouro ou ouro-paládio. O processo mais eficaz de deposição é através de um sistema de evaporação conhecido como “sputtering”. Neste, o ouro é removido de um eletrodo maciço, por um bombardeamento com íons pesados de argônio, esse deposita sobre as reentrâncias e proeminências da superfície da amostra. Através do aparelho metalizador de modelo DESK II da DENTON VACUUM, realiza a cristalização.

Condições de observação no MEV
                 O estudo em MEV de espécime biológicos geralmente faz o uso de elétrons secundários, que são produzidos pela interação de um feixe primário (sonda) com a superfície de interesse. Para espécime bem preparadas, condutores, é vantajoso trabalhar-se com feixe primário de elétrons acelerados com 20 a 25 kV, pois se ganha na resolução. Espécimes mais sensíveis podem precisar de elétrons menos energéticos, de 1 a 10 kV. Cabe ao operador reconhecer e escolher as melhores condições. Para o melhor resultado, é importante também que seja corrigido o astigmatismo da imagem; outro parâmetro importante é a escolha adequada da distância de trabalho: distâncias curtas favorecem melhor resolução, com certo sacrifício da profundidade de foco. O inverso é necessário para se fotografar com pequenos aumentos, áreas e volume grandes, garantindo boa profundidade de foco. Exemplo de Microscópio Eletrônico de Varredura que pode ser utilizado, Jeol modelo JSM 5410 JEOL.

Imagens obtidas


 
 

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