Preparo de Material Biológico para Microscopia Eletrônica de Varredura

      O microscópio eletrônico de varredura (MEV) forma imagens essencialmente tri-dimensionais e de grande efeito plástico, com uma notável profundidade de foco. Estas imagens são produzidas através da interação inicial de um feixe de elétrons com a amostra, que é mantida sob condições de alto vácuo.  

       Os métodos de preparo visam justamente contornar ou minimizar estas condições adversas, tornando as amostras resistentes e condutoras. Assim se pode dizer que o sucesso de uma boa preparação é fundamental para se garantir a melhor imagem.

      As aplicações da microscopia eletrônica de varredura em biologia incluem desde objetos macroscópicos (organismos inteiros, partes vegetais, órgãos isolados, capilares, células de cultura) até o estudo de macromoléculas orgânicas, frações celulares, etc.

Obtenção das amostras

                 Esta etapa inclui a coleta, seleção e limpeza, que visa remover matérias estranhas como muco e poeira, da superfície a ser estudada, porém sem afetar suas características originais. Superfícies ciliadas são especialmente suscetíveis à adsorção de contaminantes, e devem ser bem limpas antes da aplicação do agente fixador.

     A seleção da amostra será conduzida sob um microscópio estereoscópico, usando-se um pincel fino, um palito (agulha) ou uma pipeta, se a manipulação se der em meio aquoso; evitar o uso de pinça. As amostras como regras devem possuir as dimensões mínimas necessárias para o estudo que se pretende realizar, uma vez que as dificuldades durante a observação no MEV crescem em proporções direta com o seu volume; por outro lado, os cuidados durante a manipulação precisam ser redobrados quando as amostras são excessivamente pequenas, não ultrapassando de espessura de 1,0mm.

Estabilização da forma (fixação)

      É o processo através do qual se preserva o estado original de um espécime vivo, evitando-se ao máximo a introdução de artefatos. A duração da fixação é intencionalmente longa, visando melhor penetração do fixador e aumentar a resistência física da amostra. A fixação é geralmente feita por imersão da peça na solução fixador tamponado. Na escolha do tipo de fixador ou do roteiro de fixação devem-se considerar as dimensões da amostra, a informação pretendida e a disponibilidade dos reagentes químicos (em especial do tetróxido de ósmio). Glutaraldeído ou mistura de aldeídos são geralmente agentes fixadores de escolha universal.

Preparo do fixador de Karnovisky

SOLUÇÃO A - Água destilada + paraformaldeido + NaOH

Aquecer no microondas e verificar a transparência (± 30 seg./potencia máxima) ou em agitador por ± 15 min em temperatura alta até dissolver todo paraformaldeído. Após, Filtrar.

SOLUÇÃO B - Tampão de Cacodilato de Sódio 1M + Glutaraldeido + CaCl2

SOLUÇÃO A + SOLUÇÃO B, completar para 100ml de tampão cacodilato 0,1M e acertar pH 7,4. Conservar em geladeira.

 

Pós-fixação

                 Fixar em Tetróxido de Ósmio por 4horas. Assim, o material fica com uma cor escura (negra), o que ajuda no contraste no momento da observação ao MEV. Durante a pós-fixação é necessário lavar o material em água destilada por 3 vezes para retirar o excesso do Ósmio. Logo em seguida,  executa-se os seguinte procedimentos:

Desidratação

                  É feita basicamente com concentrações crescentes de álcoois iniciando de 30% até ao absoluto (100%).

 

Secagem das amostras
                   A secagem final das amostras é feita sob condições que por ela não passa um menisco de transição de fase. Isto se consegue na Câmara de “ponto critico”, geralmente usando dióxido de carbono.

PROCEDIMENTO DO PONTO CRITICO: Leva-se a amostra já fixada e completamente desidratada à Câmara de Ponto Crítico, em um pequeno volume de etanol absoluto. Com a Câmara isolada, injeta-se o CO₂ líquido, fazendo-se várias substituições até a remoção total do etanol. Eleva-se então a temperatura da câmara até 40-45°C, bem acima da temperatura crítica e, com o aumento gradual da temperatura, as moléculas adquirem energia cinética e se convertem em gás, o que faz aumentar simultaneamente a pressão interna da câmara. À medida que isso ocorre, a densidade da fase líquida é reduzida, e a fase gasosa é aumentada. Nesta situação, a tensão superficial é igual a zero e todo líquido se converteu em gás. Assim evita-se o efeito da tensão superficial sobre as amostras, e após isto ela é removida da Câmara seca e pronta para ser coberta com ouro. O dióxido de carbono é inerte e barato por isso geralmente adotado no método e o grau de pureza máxima do fluido é essencial para evitar contaminações. O aparelho que realiza o processo de ponto crítico pode ser de Marca IMS Modelo 850.

Montagem

                  O espécime seco precisa ser montado de modo adequado no suporte porta-amostra do MEV (“stub”), ajustando-se a melhor orientação em relação ao feixe de elétrons e ao coletor. Vários tipos de adesivos podem ser usados: cola de prata coloidal, fita adesiva, esmalte de unha contendo carbono coloidal etc. Após a colagem, as amostras, são inicialmente adsorvidas ao seu porte.

Metódos de impregnação metálica

                 É realizado para intensificar a adsorção internamente dos tecidos, de um metal condutor no caso o Tetróxido de Ósmio. Isto se faz através de um agente mordante bi-funcional, que age como uma ponte molecular entre o espécime e o “corante” eletrônico. O aumento da condutividade propicia trabalhar-se no MEV em condições de ótima resolução, ainda com metalização interna, o tecido adquire maior resistência mecânica.

A COBERTURA COM OURO: Promove o aumento da condutividade da superfície da amostra através de uma fina camada (até 20-30nm de espessura) de metal, de preferência, ouro ou ouro-paládio. O processo mais eficaz de deposição é através de um sistema de evaporação conhecido como “sputtering”. Neste, o ouro é removido de um eletrodo maciço, por um bombardeamento com íons pesados de argônio, esse deposita sobre as reentrâncias e proeminências da superfície da amostra. Através do aparelho metalizador de modelo DESK II da DENTON VACUUM, realiza a cristalização.

Condições de observação no MEV

                 O estudo em MEV de espécime biológicos geralmente faz o uso de elétrons secundários, que são produzidos pela interação de um feixe primário (sonda) com a superfície de interesse. Para espécime bem preparadas, condutores, é vantajoso trabalhar-se com feixe primário de elétrons acelerados com 20 a 25 kV, pois se ganha na resolução. Espécimes mais sensíveis podem precisar de elétrons menos energéticos, de 1 a 10 kV. Cabe ao operador reconhecer e escolher as melhores condições. Para o melhor resultado, é importante também que seja corrigido o astigmatismo da imagem; outro parâmetro importante é a escolha adequada da distância de trabalho: distâncias curtas favorecem melhor resolução, com certo sacrifício da profundidade de foco. O inverso é necessário para se fotografar com pequenos aumentos, áreas e volume grandes, garantindo boa profundidade de foco. Exemplo de Microscópio Eletrônico de Varredura que pode ser utilizado, Jeol modelo JSM 5410 JEOL.

Imagens obtidas

 

 

Microscopia Eletrônica - Transmissão e Varredura

                    O desenvolvimento da microscopia eletrônica teve início a partir dos estudos do comportamento ondulátorio dos elétrons. A microscopia eletrônica apresenta vários tipos de aparelhos com especificidade quanto ao funcionamento e utilização.

                    O microscópio eletrônico de transmissão (MET) é composto por uma fonte geradora de elétrons que caminha por um sistema de lentes eletromagnéticas dispostas em coluna. Os elétrons têm que interagir com o objeto para formar a imagem em uma tela fluorescente, para isso, o objeto deve ser extremamente fino para permitir a passagem dos elétrons. O poder de resolução do MET é bem maior que o do microscópio optico (maior 2000 vezes), o que permite maior profundidade de foco (só é possível visualizar organelas com MET).

Microscopia eletrônica de transmissão mostrando uma mitocôndria.
Fonte: Google imagens

                  O microscópio eletrônico de varredura (MEV) é um aparelho mais simples, menor e mais barato, que permite a obtenção de imagens tridimensionais dos materiais em estudo. Os feixes de elétrons atuam sobre a superfície do material. A amostra é muitas vezes recoberta com metais pesados (como urânio e chumbo) para aumentar o poder dispersante das estruturas e com isso a resolução.

Microscopia eletrônica de varredura mostrando a penetração do ovúlo no espermatozoide
Fonte: Google imagens

Simulador de microscópio para educação a distância - MIRA

               Com o objetivo de fornecer aos estudantes de Educação a Distância (EaD) conhecimentos que lhes permitam manipular um microscópio, e proporcionar um conteúdo com atividades educativas que antes só seriam viáveis em laboratório, o Centro Integrado de Aprendizagem em Rede (Ciar) da UFG lançou  o Microscópio Simulado em Realidade Virtual Aumentada (Mira). O lançamento foi no dia 4 de agosto de 2010, na sede do Ciar. 



                O software foi desenvolvido por meio de uma parceria entre o Ciar e o Instituto de Ciências Biológicas (ICB). O microscópio possui recursos didáticos que orientam o estudante de Educação a Distância, permitem conhecer o aparelho e realizar a leitura de lâminas mesmo que virtualmente. Por meio do Mira, os estudantes poderão visualizar células do banco de dados do programa e analisá-las como se estivessem diante de um microscópio real. 



Imagem da visão de um microscópio através do Mira. O aluno terá recursos como, por exemplo, alterar a posição das lâminas virtuais e o foco.

              Além disso, o microscópio conta com uma tecnologia de marcadores de realidade aumentada (já muito utilizada no meio publicitário) que são uma espécie de fichas contendo imagens que a webcam do aluno deverá decodificar para que sejam projetadas as imagens na tela do computador. 

             O projeto nasceu da necessidade de professores da modalidade EaD do curso de especialização em Tecnologias Aplicadas ao Ensino de Biologia da UFG. Assim, os alunos desse curso de especialização poderão a qualquer hora e local trabalhar com o microscópio mesmo virtualmente.  O recurso será disponibilizado na forma de um Cd-rom facilmente executável em qualquer computador. 

             De acordo com um dos participantes da equipe que desenvolveu o Mira, Silvestre Linhares, já existe a previsão de complementação do microscópio.  

O simulador permitirá ao estudante a visualização em três dimensões de um microscópio, além de fornecer as funções e a localização de cada parte de um aparelho real.

                Pelo CIAR, a coordenação do projeto é feita pelo professor Wagner Bandeira. Pelo ICB, a coordenação é da professora Simone Maria Teixeira de Sabóia Morais. Imagens e descrições foram feitas pelos professores Joana Cristina Neves de Menezes Faria, Moemy Gomes de Moraes e José Oscar Rodrigues de Morais.

Fonte: http://www.ufg.br/page.php?noticia=6338

Esfregaço da Mucosa Bucal

                O esfregaço bucal é um procedimento muito utilizado em jogos olímpicos e outros eventos esportivos, em casos de suspeita que um homem esteja tentando competir se passando por uma mulher. Muitos médicos no passado indicavam o procedimento para detectar o desenvolvimento sexual anormal e genitália ambígua.

                O esfregaço bucal evidencia a cromatina sexual que é o corpúsculo de Barr e está presente apenas em indivíduos do sexo feminino, onde o cromossomo X fica condensado enquanto o outro alelo X se manifesta, expressando as características femininas.

                Durante o procedimento de esfregaço bucal é preparado uma lâmina provisória, no qual são rompidas as junções celulares do tecido epitelial da bochecha e as células são preservadas em álcool 70% que serve para fixar o material biológico preparando-o para a coloração. A coloração utilizada durante a aula prática foi hematoxilina que é um corante com caráter básico que reage com os ácidos nucléicos conferindo ao núcleo uma coloração azulada. Após esta etapa foi colocada a lamínula sobre a lâmina, e o material  estava pronto para ser analisado.

            A análise ao microscópio de luz permite a visualização das células do tecido epitelial onde observa-se apenas os limites entre núcleo e citoplasma e também a presença do corpúsculo de Barr que se caracteriza por um ponto localizado ao lado do núcleo, possuindo a mesma coloração azulada. Para essa metodologia pode ser usado vários tipos de corantes sendo os mais comuns azul de metileno e Hematoxilina-Eosina (HE). 

Células da mucosa bucal coradas com HE. Aumento de 100X.
Fonte: Google imagens

 

Célula da mucosa bucal. Aumento de 400X. Presença de corpuscúlo de barr.
Fonte: Google imagens



Lâminas provisórias também podem ser análisadas ao microscópio.

Processamento de Material Biológico

SACRIFÍCIO
O peixe foi coletado no aquário e em seguida morto pela técnica de decaptação.

DISSECAÇÃO
Nesse momento é realizada a coleta do órgão ou tecido a ser analisado. Para que ocorra uma boa fixação o material não pode ultrapassar ao tamanho máximo de 0,5 cm de espessura.

FIXAÇÃO
Fixadores são substancias químicas que mantém a integridade do tecido após a morte do animal. As finalidades básicas dos fixadores são: evitar  alterações da constituição química celular, fixar proteínas, inativar enzimas proteolíticas responsáveis pelos fenômenos de autólise e permitir o estudo da célula como se estivesse in vivo. A caracteristica da fixação é o endurecimento do tecido. O fixador usual é o Karnovsky.

DESIDRATAÇÃO
É o processo que retira a água do interior da célula. A desidratação deve ocorrer em etapas progressivas por meio da passagem do material biológico em concentrações crescentes de álcool etílico (70%, 80%, 90%, 95%, 100%). Isso é importante, pois a desidratação violenta  e rápida, quando a peça é diretamente colocada no álcool 100%, pode causar lesões estruturais e irreversíveis na célula.

DIAFANIZAÇÃO
O Xilol tem finalidade de ocupar todos os lugares antes ocupados pela a água e permitir a penetração da parafina. A diafanização deixa o material translúcido. Para evitar mudanças bruscas, a peça dever passar por uma mistura de Alcool + Xilol (1:1) e posteriormente em banhos de Xilol absoluto.

INCLUSÃO EM PARAFINA
Quando translúcido o tecido fica em condições de receber a parafinação. Esta etapa é realizada na estufa a 60°C com a parafina fundida. A parafina liquefeita infiltra-se no tecido diafanizado com facilidade. A parafinização tem como finalidade impregnar nos tecidos para que estes adquiram consistência para a realização da microtomia.

CONFECÇÃO DO BLOCO
A parafina fundida é colocada em caixinhas de papel grosso e deixados a temperatura ambiente. Nesta etapa a parafina solidifica-se tomando forma de bloco. O início da solidificação da parafina é aproveitado para orientar a posição da peça visando o sentido dos cortes a serem obtidos.

MICROTOMIA
Uma vez preparados os blocos eles estão prontos para serem cortados em aparelhos denominados de micrótomo. Os cortes poderão ter espessura mínima de 1µm, sendo que na prática diária, são cortados de 5 a 7µm. Para a realização dos cortes os blocos de parafina são colados em suportes de madeira que facilitam o encaixe no micrótomo.

DISTENSÃO DOS CORTES
Para colocar os cortes na lâmina pode utilizar-se o banho maria, onde são colocados na água e pescados, ou pode-se utilizar a placa aquecedora. Ambos os métodos permitem a distensão dos cortes.  Em seguida as lâminas devem ser colocadas em estufas para secar.

COLORAÇÃO
São as técnicas tintoriais empregadas para facilitar o estudo dos tecidos sob microscopia, uma vez que os tecidos naturalmente são transparentes. Antes do uso do corante é necessário desparafinar a lâmina por meio de banhos de xilol, reidratar o corte por meio da passagem em concentrações decrescentes de álcool etílico (100%, 95%, 90%, 80%, 70%). Existem muitas técnicas de coloração, portanto a mais usual é a Hematoxilina e Eosina (HE).

MONTAGEM

É o fechamento dos cortes corados entre lâmina e lamínula, com auxilio de uma resina sintética denominada de Entelan. A montagem implica meio conservador que não altera a coloração.

Após todos esses procedimentos supracitados, o material está pronto para ser visualizados no microscópio de luz.



Microscópio: estudando as células

                  O olho humano só consegue distinguir dois pontos separados por mais de 0,1 milímetros. Dessa forma, antes do surgimento dos microscópios era difícil realizar estudos celulares. A invenção do microscópio foi realizada por holandeses por volta de 1590, no entanto, a descoberta das células ainda demorou muitos anos, e aconteceu apenas em 1665. Robert Hook, ao observar um pedaço de cortiça notou a existência de pequenos compartimentos, que ele batizou de células. O microscópio que ele utilizou havia sido desenvolvido por ele próprio, e ainda era muito rudimentar o que impossibilitou o aprofundamento de sua descoberta. A teoria celular foi formulada apenas em 1839.

Fonte: Google Imagens

                O microscópio de luz funciona como um conjunto de lentes que ampliam a imagem que é transpassada por um feixe luminoso. Para que a imagem seja formada é preciso que aconteça a interação da luz com o espécime, de forma que este obsorva ou refrate os raios, criando contraste entre o objeto e o meio que o envolve.

                 Componente ópticos e mecânicos formam o microscópio de luz. Os ópticos são a fonte de luz, o condensador, as objetivas e a ocular, e eles participam direta ou indiretamente da formação da imagem ampliada do objeto na retina do observador. Os componentes mecânicos estabilizam o sistema de lentes que produzirá a imagem, e são eles a base ou pé, o braço, a platina, os parafusos macrométrico e micrométrico, o revolver das objetivas e o canhão da ocular. Os componente ópticos e mecânicos contribuem conjuntamente para a qualidade da imagem formada. 

Componentes do microscópio de luz

                  O aumento de uma estrutura é dado pela aumento da objetiva (aumenta o poder de resolução que é a capacidade de diferenciar dois pontos próximos) multiplicado pelo aumento da ocular (aumenta o tamanho do material). Um microscópio sempre tem várias objetivas (10, 20, 40 e 100X), já o aumento proporcionado pela ocular sempre é 10X.

                  Na microscopia de luz existem muitos tipos de aparelhos que diferem entre si pelos sistemas de lentes e filtros, para assim diversificar as imagens formadas. Os diversos tipos de microscópios permitem solucionar dois problemas: da transparência dos componentes celulares devido ao alto conteúdo de água e consequentemente o baixo contraste. Entre os tipos especiais de microscopias destacam-se:

Contraste de fase: usado para o estudo de células vivas, não coradas. Gera uma imagem com diferentes graus de obscuridade ou luminosidade. No contraste negativo o material aparece brilhante em um fundo escuro, já no contraste positivo o material aparece escuro em um fundo brilhante.

Campo escuro: o espécime é iluminado com luz obliqua. A dispersão da luz gerada por um ajuste optico fornece um plano totalmente escuro e aumenta o contraste da imagem para salientar pequenos detalhes.

Fluorescência: uma estrutura fluorescente emite brilho contra um fundo escuro. Existem compontentes celulares naturalmente fluorescente e outros que podem se ligar a substância fluorescentes. O microscópio fluorescente é alimentado por uma luz de mercurio de alta pressão e possuem filtros de excitação para detectar o brilho do material contra o fundo escuro.

Células: a unidade básica da vida

                  Todos os seres vivos, com exceção dos vírus, são constituídos por células. Somente a célula tem a capacidade de manter a vida e de transmiti-la. As formas mais simples de vida são os organismos unicelulares, que possuem apenas uma célula. No entanto existem formas da vida que contêm associações de células, sendos elas as colônias unicelulares ou os organismos multicelulares. Existem dois tipos principais de células, as procarióticas e as eucarióticas:

Célula Procariótica

Célula Eucariótica

               As células procarióticas não tem envoltório nuclear, os cromossomos ficam no nucleóide e em contato direto com o resto do protoplasma. As células eucarióticas possuem núcleo verdadeiro com um envoltório nuclear onde ocorrem trocas nucleocitoplasmáticas. As células eucarióticas podem ser classificadas em animal e vegetal com base em suas diferenças estruturais e funcionais. As células animais possuem características exclusivas como a presença de lissossomo, de centríolos e de flagelos. As células vegetais também possuem características particulares, como a presença de parede celular, de cloroplastos e de vacúolo central.